Für die Diagnosestellung eines Hirntumors ist eine Reihe von Untersuchungen erforderlich. 

Zu Beginn steht eine ausführliche Befragung zur Krankheitsgeschichte. Dabei sind Angaben zu Beschwerden, zum Auftreten bisheriger Tumorerkrankungen beim Betroffenen und in dessen Familie, sowie zu anderen vorliegenden Begleiterkrankungen wichtig.  Es schließt sich eine allgemeine körperliche Untersuchung und eine klinisch-neurologische Untersuchung an. Diese gibt erste Hinweise auf den Ort und das Ausmaß der Schädigung im zentralen Nervensystem. Sie ist auch zur Beurteilung späterer Folgen von Tumorprogression und Therapie von großer Bedeutung.

Bei klinischem Verdacht auf einen Hirntumor wird eine Computer- oder Kernspintomographie (MRT-Untersuchung) ohne und mit Kontrastmittelgabe durchgeführt. Die MRT ist bei Beachtung ihrer Kontraindikationen die Methode der Wahl, da sie das Hirngewebe und die Lokalisation des Tumors sehr genau und in verschiedenen Schnittführungen darstellen kann. Sie wird in der Regel mit einem standardisierten Protokoll mit ergänzenden spezifischen MRT-Sequenzen (z.B. Perfusions- und Diffusionssequenzen) durchgeführt. Zusätzlich dienen die Aufnahmen zur differentialdiagnostischen Einordnung (Tumor vs. Entzündung, Abszess, Lymphom, Metastase), Einschätzung der Malignität oder aber auch im Verlauf der Erkrankung zur Einschätzung des Therapieansprechens bzw. Therapieversagens. Die Computertomographie ist in der Notfalldiagnostik schneller verfügbar und in der Regel ausreichend; zudem ist sie deutlich besser zum Nachweis von Verkalkungen geeignet.  Neben der MRT werden sehr häufig nuklearmedizinische Untersuchungen, die so genannte Positronenemissionstomographie („PET“) mit kurzlebigen radioaktivmarkierten Aminosäuren z.B. 11C-Methionin („MET-PET“) oder 18-Fluorethyltyrosin („FET-PET") durchgeführt. Mit Hilfe der Aminosäure-PET können stoffwechselaktive Tumoranteile, zystische Areale oder Nekrosen von gesundem Hirngewebe differenziert werden. Die Spezifität der MET- und FET-PET ist für die Markierung der Tumorkonturen und die Differenzierung Rezidivtumor vs. Strahlennekrose im Vergleich zur MRT höher. Außerdem wird das Aminosäure-PET genutzt, um frühzeitig eine weitere Malignisierung des Tumors (Übergang von einem niedriggradigen langsam wachsenden Gliom zu einem hochgradigen Gliom mit hoher Proliferationsaktivität) festzustellen.  Die Informationen aus den MRT- und PET-Untersuchungen werden auch für die weitere Therapieplanung genutzt. Dazu zählen die Definition des präoperativen Tumorvolumens, die Planung stereotaktischer Biopsien und die Zielvolumenberechnung bei der Strahlentherapie.  In ausgewählten Fällen z.B. bei Meningeomen wird auch eine konventionelle Angiographie (DSA) zur Darstellung der Gefäßversorgung des Tumors durchgeführt. Dabei wird über einen Katheter ein Röntgenkontrastmittel  in die hirnversorgenden Gefäße injiziert. Über den gleichen Zugang können auch Tumorgefäße  dauerhaft mittels Tumorembolisation verschlossen werden. 

Das EEG dient als Indikator der Krampfbereitschaft und ist bei symptomatischen Anfällen für die weitere Therapieplanung hilfreich.

Bei Verdacht auf eine Aussaat von Tumorzellen in das Nervenwasser (Liquor) wird eine sog. Lumbalpunktion vorgenommen. Die Probenentnahme erfolgt unterhalb des Rückenmarks, so dass  das Rückenmark nicht verletzt werden kann. Dabei wird im unteren Bereich der Wirbelsäule eine feine Nadel zwischen zwei Wirbeln durch die harte  Rückenmarkhaut hindurch in den  Liquorraum eingeführt und eine Probe entnommen. Mit einer Untersuchung des Liquors kann man erkennen, ob sich Tumorzellen gelöst und im Rückenmarkskanal verteilt haben. Eine solche „meningeale Aussaat“ lässt für manche Tumoren Rückschlüsse auf das Stadium zu und hat entsprechende Konsequenzen für die Planung der Therapie.

Die apparativen Untersuchungen allein lassen noch keine Artdiagnose des Tumors zu. Hierzu ist die Entnahme von Tumorgewebe (Biopsie) erforderlich, das anschließend in der Neuropathologie feingeweblich (histologisch) oder auch molekularbiologisch untersucht und beurteilt wird. Diese Untersuchung wird meist im Rahmen der Operation durchgeführt. Die Biopsie ist aber bei diffus wachsenden oder schwer zugänglichen Prozessen manchmal auch zur weiteren Behandlung schon vor oder statt der Tumorresektion notwendig. Dann wird mit einer sehr feinen Nadel eine Probe aus dem verdächtigen Areal entnommen. Die Biopsie wird entweder nach Eröffnung der Schädeldecke („offene Biopsie“) oder über ein kleines Bohrloch nach Fixierung des Kopfes in einem so genannten Stereotaxie-Rahmen („stereotaktische Biopsie“) durchgeführt. Letztere kann auch in örtlicher Betäubung („Lokalanästhesie“) vorgenommen werden.

Neben der histologischen Diagnostik spielen in der modernen Neuroonkologie molekulare Marker eine immer wichtigere Rolle. Diese können zur Prognoseabschätzung, aber auch zur Abschätzung des Ansprechens einer Chemo- oder Strahlentherapie herangezogen werden. In klinischen Studien werden diese Marker zunehmend dafür verwendet, Patienten in bestimmte Behandlungsgruppen zu unterteilen. Bei der molekularen Klassifikation der Gliome werden aktuell drei Marker herangezogen: der gleichzeitige Verlust genetischen Materials auf dem kurzen Arm des Chromosoms 1 und des langen Arms des Chromosoms 19 („1p/19q-Kodeletion“), der Aktivierungszustand eines Genabschnitts, der für die Bildung eines bestimmtes Reparaturenzyms, der so genannten Methyl-Guanin-Methyl-Transferase („MGMT“) zuständig ist, sowie eine spezifische Veränderung im Gen der so genannten Isozitrat-Dehydrogenase („IDH1-Mutation“).