Arbeitsgruppe Mammakarzinom

Mitarbeiter: Dr. rer. nat. Martin Götte

Kooperationspartner: Dr. C. Kersting, Prof. Dr. H. Bürger (Gerhard-Domagk-Institut für Pathologie, UKM); Prof. Dr. C. Bremer (Institut für Radiologie, UKM); Dr. G. Hudelist, Prof. Dr. C. Singer (Universität Wien); PD Dr. C. Krusche (Universität Aachen) Das Mammakarzinom ist der häufigste maligne Tumor der Frau mit weltweit über einer Million Neuerkrankungen pro Jahr. In Deutschland erkrankt etwa jede zehnte Frau im Laufe ihres Lebens daran. Ferner stellt das Mammakarzinom in Deutschland die häufigste Krebstodesursache dar (41,9 je 100.000 Frauen; 17,1% tumorbedingte Mortalität). Da der Tumortod beim Mammakarzinom zumeist durch eine distante Metastasierung bedingt ist, gilt die adjuvante systemische Therapie (ergänzend zur Operation und Radiatio) derzeit als Therapiestandard. Ziel der adjuvanten systemischen Therapie ist dabei, vermutete Tumorreste und Mikrometastasen kurativ zu behandeln. Man versucht dabei, die Wahl der systemischen Therapie (zytotoxische Chemotherapie und/oder endokrine Therapie) dem individuellen Rezidiv- und Metastasierungsrisiko der jeweiligen Patientin anzupassen. Erschwert wird dies durch die große Heterogenität des Erkrankungsverlaufes des Mammakarzinoms und den Mangel an zuverlässigen Prognosefaktoren, so daß immer auch Patientinnen "unnötig" eine Chemotherapie erhalten, deren niedriges Risiko nicht erkannt wird. Insofern gilt das Interesse der (gynäko-) onkologischen Forschung derzeit u.a. der Identifizierung neuer valider Prognosefaktoren und der Erschließung alternativer, "zielgerichteter" und nebenwirkungsärmerer Therapiestrategien ("targeted therapies") des Mammakarzinoms.

Die so genannte Endothelin (ET)-Achse besteht aus den drei Peptiden, ET-1, ET-2 und ET-3, sowie den beiden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, ETAR und ETBR

Erste in vivo Versuche am Nacktmaus-Modell mit MCF-7 Xenograft-Tumoren ergaben eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums durch frühzeitige Administration des selektiven ETAR-Antagonisten Atrasentan (Fa. Abbott Laboratories, USA)

Fragestellungen

Bedeutung der Endothelin-A-Rezeptor Expression beim Mammakarzinom und Möglichkeiten der therapeutischen Einflussnahme In den vergangenen Jahren ist das Interesse der onkologischen Wissenschaft an der Bedeutung der Endothelin-Achse und insbesondere des ETA-Rezeptors für die Entstehung und Progression von Malignomen stetig gewachsen und auch beim Mammakarzinom scheinen die Endotheline eine Rolle zu spielen.
Unsere Arbeitsgruppe hat in den vergangenen Jahren die Expression, Regulation und Bedeutung der ET-Achse beim Mammakarzinom untersucht. Die folgenden Aussagen können aus unseren bisherigen Studien abgeleitet werden:

Die ETAR Expression ist beim malignen signifikant höher als beim benignen Mammagewebe, während für ETBR tendenziell im Normalgewebe eine höhere Expression nachweisbar ist. Dies macht den ETAR zu einem interessanten Target beim Mammakarzinom. Int J Oncol 2005
Ein Großteil der ex vivo charakterisierten Mammakarzinome zeigt eine deutliche ET-1, ETAR und ETBR Protein-Expression. Int J Oncol 2005; Clin Cancer Res 2003
Die Protein-Expression von ET-1 und ETAR nimmt vom "Normalgewebe", welches überwiegend ET-negativ war, über das Carcinoma in situ bis hin zum invasiven Karzinom zu. Dies deutet darauf hin, daß ein Anstieg der Expression der ET-Achse mit der Akquisition von malignem Potential (Karzinogenese) und der weiteren Krankheitsprogression beim Mammakarzinom einhergehen könnte. Oncology Reports 2004
Die Expression der ET-Achse und insbesondere die ETAR Protein-Expression bei Mammakarzinomen korreliert mit klinischen bzw. histopathologischen Parametern, die aggressivere Formen des Mammakarzinoms charakterisieren. Eine hochinteressante Ausnahme stellt jedoch die Korrelation der ET-Rezeptor Expression mit Östrogenrezeptor-positiven Karzinomen dar. Clin Cancer Res 2003
Die ETAR Protein-Expression ist ein negativer Prognosemarker beim Mammakarzinom: Patientinnen mit einem ETAR-positiven Mammakarzinom haben ein signifikant kürzeres krankheitsfreies Überleben (DFS). Interessanterweise kommt der negative prognostische Wert der ETAR Expression insbesondere in der Subgruppe von Patientinnen zum Tragen, die im Hinblick auf die "klassischen Prognosefaktoren" beim Mammakarzinom einen vermeintlich günstigeren Krankheitsverlauf hätten zeigen müssen. Möglicherweise könnte die Bestimmung der ETAR Expression beim Mammakarzinom daher dazu beitragen, die Vorhersage von Rezidiv und Tumortod zu verbessern und somit einen Beitrag zu einer individuell auf die einzelne Patientin zugeschnittenen, adjuvanten Therapie des Mammakarzinoms leisten. Clin Cancer Res 2003
Die ETAR Protein-Expression beim Mammakarzinom ist ein unabhängiger negativer Prädiktor für das Therapieansprechen beim Mammakarzinom: Patientinnen mit einem ETAR-positiven lokal fortgeschrittenen Mammakarzinom sprechen signifikant schlechter auf eine neoadjuvante EC-Chemotherapie an als Patientinnen mit einem ETAR-negativen Tumor. Br J Cancer 2004
Die Expression der ET-Achse bei Mammakarzinom-Proben (ex vivo) korreliert mit der MVD sowie mit der VEGF Expression. Ferner läßt sich die ETAR Expression bei verschiedenen humanen Mammakarzinom-Zellinien in vitro durch Hypoxie induzieren. Insofern spielt die ET-Achse und v.a. der ETAR offensichtlich eine Rolle bei der Regulation der Angiogenese des Mammakarzinoms. Clin Cancer Res 2004
Die Charakterisierung verschiedener etablierter humaner Mammakarzinom-Zellinien hinsichtlich ihrer mRNA- und Protein-Expression der ET-Achse ergab, daß alle untersuchten Zellinien (MCF-7, HBL-100, SK-BR-3, MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT-474) eine ET-1 und ETAR Expression aufweisen, während bei keiner der Zellinien eine ETBR Expression nachweisbar war. Int J Oncol 2005
Die Zellinien MCF-7 und HBL-100 exprimieren den ETAR konstitutiv. Int J Oncol 2005
Bei vier weiteren Mammakarzinom-Zellinien (SK-BR-3, MDA-MB-453, MDA-MB-468 und BT-474) war die ETAR mRNA- und Protein-Expression durch 17ß-Östradiol signifikant zu steigern. Dies deutet in Zusammenschau mit den Daten der ex vivo Analyse von Mammakarzinom-Präparaten, bei der eine enge Assoziation der ETAR und ER Expression auffiel, auf eine endokrine Regulation der ETAR Expression hin. Daraus könnten sich möglicherweise interessante Therapiekonzepte im Sinne einer Kombination endokriner Therapieansätze mit ETAR-Antagonisten beim Mammakarzinom ergeben, welche derzeit in weiteren Studien in vitro und in vivo untersucht werden. Int J Oncol 2005
Weiterhin war bei diesen Zellinien eine Hypoxie-induzierte Hochregulation der ETAR Expression zu beobachten. Die Steigerung der ETAR Expression könnte eine Art "Escape"-Mechanismus der Tumorzellen darstellen, da ET-1 via ETAR vermittelt bei Malignomen zu Proliferation, Angiogenese und Anti-Apoptose führt und eine hohe ETAR Expression somit einen potentiellen Überlebensvorteil für die Zelle darstellt. Da Tumoren häufig hypoxisch sind, könnte dies möglicherweise auch die ETAR Überexpression bei Malignomen (u.a. beim Mammakarzinom) erklären. Dieser Zusammenhang läßt das Targeting des ETAR beim Mammakarzinom als eine potentiell interessante Therapiestrategie erscheinen. Int J Oncol 2005
Die Ergebnisse der ersten in vivo Studien zeigen, daß die ETAR-Inhibition beim Mammakarzinom eine Hemmung des Tumorwachstums bewirkt. Insbesondere kann durch eine frühe Applikation des Atrasentans (zum Zeitpunkt der Tumorzell-Injektion) die Entstehung von Xenograft-Tumoren in der Hälfte der Fälle komplett verhindert werden. Diese Effekte sind möglicherweise auf eine Hemmung der Tumorzell-Implantation sowie der nachfolgenden Tumorigenese durch den ETAR-Antagonisten zurück zu führen. In allen Fällen - auch bei Tieren, bei denen ein Anwachsen der Xenograft-Tumoren unter Atrasentan-Gabe auftrat - waren eindeutig therapeutische Effekte der ETAR-Inhibition mit signifikant kleineren Tumoren zu beobachten. Weiterhin konnten antiangiogene Effekte des Atrasentans beim Mammakarzinom in vivo dargestellt werden. Diese Daten unterstützen eine potentielle therapeutische Bedeutung selektiver ETAR-Antagonisten beim Mammakarzinom.

Endothelinsystem & Hypoxie beim Mammakarzinom Tumorhypoxie ist in soliden Mammakarzinomen weit verbreitet und stellt hier einen wesentlichen Stimulus für Angiogenese, Invasion und maligne Progression dar. Im Mittelpunkt der Hypoxie-vermittelten Aktivierung verschiedener Schlüsselgene steht der hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1α). Unsere Arbeitsgruppe untersucht in verschiedenen Ansätzen die Interaktion zwischen der hypoxic response der Tumorzellen und dem Endothelinsystem. In diesem Zusammenhang konnte bisher gezeigt werden, dass

beim Mammakarzinom die Überexpression von HIF-1α signifikant mit der ET-1-Expression korreliert
Hypoxie die zelluläre Sekretion von ET-1 stimuliert und so indirekt die Invasivität der Brustkrebszellen steigert
die Hypoxie-induzierte Invasion maßgeblich durch parakrine Effekte von ET-1 vermittelt wird.

Von besonderer Bedeutung ist darüber hinaus die Beobachtung, dass der selektive ETAR-Antagonist Atrasentan in der Lage ist, die Hypoxie-induzierte Invasion von Brustkrebszellen wirksam zu verhindern.

Induktion der ET-1-Sekretion aus MCF-7 Brustkrebszellen unter hypoxischen Bedingungen

Hemmung sowohl der ET-1-vermittelten als auch der Hypoxie-induzierten Invasion von MCF-7 Brustkrebszellen durch den selektiven ETAR-Antagonisten ABT-627 (Atrasentan)

Bedeutung von Endothelin-Converting Enzyme (ECE) und Neprilysin beim Mammakarzinom ET-1 wird in vivo durch proteolytisches Processing aus biologisch inaktiven Vorstufen gebildet; der entscheidende Schritt wird dabei durch das sog. Endothelin-Converting Enzyme-1 (ECE-1) katalysiert. Der Abbau von ET-1 erfolgt neben der Bindung an ETBR mit anschließender Internalisierung vor allem durch die Zinkpeptidase Neprilysin (NEP). Damit ergibt sich die Möglichkeit, das Endothelinsystem auch durch Interaktion mit diesen beiden Enzymen zu pharmakologisch zu beeinflussen. Unsere bisherigen Daten deuten auf eine graduelle Änderung der ECE/NEP-Expression im Rahmen der Karzinogenese hin. Die Analyse von 600 Gewebeproben aus primären Mammakarzinomen ergab eine Korrelation der ECE-Expression mit der VEGF- bzw. ETAR-Expression (p < 0,001 bzw. 0,048). Bei Patientinnen mit ECE-positiven Tumoren zeigte sich ein erhöhtes Rezidivrisiko; bei Patientinnen mit NEP-positiven Tumoren dagegen fand sich ein Überlebensvorteil mit längerem krankheitsfreiem (DFS) sowie Gesamtüberleben (OS). In vitro konnten wir einen Einfluß von ECE/NEP auf Proliferation, Migration und Invasion nachweisen, wobei ein aggressiveres Verhalten der Brustkrebszellen mit erhöhter ECE-Expression assoziiert war. Umgekehrt wurde das Proliferationsverhalten durch ECE-Antagonisten günstig beeinflußt. Besonders viel versprechend sind erste Versuche mit selektiven, nicht-peptidischen ECE-1-Inhibitoren. Für diese Substanzklasse konnte von unserer Arbeitsgruppe eine antiinvasive Wirksamkeit in Brustkrebszellen nachgewiesen werden. Diese Wirksamkeit wird derzeit in vivo anhand von Xenograft-Metastasierungsmodellen weiter untersucht.

Relativer Anstieg der ECE-1-Expression in primären Mammakarzinomen während der malignen Progression

Reduktion des invasiven Potentials von MCF-7 Brustkrebszellen durch den selektiven ECE-1-Inhibitor RO 67-7447

Synergistische Effekte durch die Kombination von selektiven ETAR-Antagonisten mit endokrinen Therapeutika (Aromataseinhibitoren, Antiöstrogene, SERMs) In vitro: kombinierter Einsatz verschiedener endokriner Therapeutika mit ETAR-Antagonisten, Untersuchung möglicher additiver Effekte bei der Reduktion von Proliferation, Migration und Invasivität In vivo: kombinierter Einsatz verschiedener endokriner Therapeutika mit ETAR-Antagonisten, Untersuchung möglicher additiver antitumoraler Effekte sowie des Einflusses auf das Metastasierungsverhalten in vivo Cross-talk zwischen der ET-Achse und der HER2- bzw. VEGF-vermittelten Signaltransduktion beim Mammakarzinom: Kombiniertes targeting von ETAR und HER2 bzw. VEGF. Mit der erfolgreichen Einführung von Trastuzumab (Herceptin®) in die Therapie des Mammakarzinoms ist in den vergangenen Jahren die Entdeckung und Beschreibung neuer potentieller therapeutischer Zielstrukturen (targets) massiv vorangeschritten. Aufgrund des komplexen Zusammenspiels mehrerer Signalwege erweist sich die Hemmung eines einzelnen targets jedoch oft als wenig effektiv. Der Tumorzelle stehen diverse Kompensationsmöglichkeiten zur Verfügung, um ihren Stoffwechsel aufrechtzuerhalten. Es kommt zur Wirkungsabschwächung bis hin zur Resistenzentwicklung gegenüber einer zielgerichteten Therapie. Ein neuer Ansatz besteht daher darin, in mehrere für die Tumorzelle lebenswichtige Signalwege parallel einzugreifen. Dadurch kann die Wirksamkeit der zielgerichteten antitumoralen Therapie gesteigert werden und auf den Einsatz herkömmlicher Chemotherapeutika möglicherweise verzichtet werden. ET-Achse und HER2: In diesem Teilprojekt beschäftigen wir uns mit potenziellen Interaktionen zwischen der ET-Achse und dem Wachstumsfaktorrezeptor HER2 beim Mammakarzinom. Hierbei soll der potenzielle Nutzen eines kombinierten targeting dieser Zielstrukturen gegenüber einer Monotherapie in vitro und in vivo evaluiert werden. In vorangegangenen Studien an 200 Mammakarzinomproben konnten wir bereits zeigen, daß beim Mammakarzinom die Expression von HER2 mit der ETAR-Expression korreliert [Wülfing et al. 2003]. Darüber hinaus wurde eine Beeinflussung der ET-1-Gen- und Proteinexpression durch EGF und Trastuzumab beobachtet. Die parallele Hemmung der ET-1-vermittelten Effekte mit Hilfe des selektiven ETAR-Antagonisten Atrasentan und des HER2-signalling durch Trastuzumab war bezüglich einer Proliferationshemmung von HER2-überexprimierenden Mammakarzinom-Zelllinien der jeweiligen Monotherapie überlegen [Fischgräbe et al. unpublished].

Mögliche Interaktionswege zwischen der ET-Achse und der EGFR-/HER2-Signaltransduktion [Vacca et al. 2000, Daub et al. 1996]

Relative ET-1-Sekretion (%) von BT-474 Mammakarzinom-Zellen nach Behandlung mit Trägerlösung (C), EGF 100 ng/mL (EGF) und EGF 100ng/mL nach 20 min Präinkubation mit Trastuzumab 10µg/mL (EGF+T). *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.001 bezogen auf die jeweilige Kontrolle (C). [Fischgräbe et al., unpublished]

Relative Proliferation (%) von BT-474 Mammakarzinom-Zellen nach Behandlung mit Trastuzumab (T) und Atrasentan (A) bezogen auf die mit Trägerlösung behandelte Kontrolle. *p ≤ 0.05 bezogen auf die Trastuzumab 10µg/mL Monobehandlung. [Fischgräbe et al., unpublished]

ET-Achse und VEGF: Analog zu dem oben beschriebenen Teilprojekt beschäftigen wir uns mit der Aufklärung molekularer Interaktionen zwischen der ET-Achse und der VEGF-vermittelten Signaltransduktion. Beide Signalwege spielen eine essenzielle Rolle bei der Tumorangiogenese [Salani et al. 2000, Folkman 1995]. Der gegen VEGF gerichtete monoklonale Antikörper Bevacizumab wurde auf Grund einer positiven Studienlage kürzlich für die Therapie des metastsierten Mammakarzinoms in Kombination mit Paclitaxel zugelassen [Miller et al. 2005]. Um bei einem definierten Patientenkollektiv in Zukunft auf die Gabe herkömmlicher Chemotherapeutika verzichten zu können, stellt die Kombination von Bevacizumab mit ETAR-Antagonisten möglicherweise eine effektive, nebenwirkungsarme Alternative dar. Auf Gewebeebene konnten wir bereits eine Korrelation zwischen ET-1 und VEGF nachweisen [Wülfing et al. 2004]. Im weiteren Verlauf dieses Projektes soll der molekulare Cross-talk zwischen beiden Signalwegen beim Mammakarzinom näher untersucht werden. Darüber hinaus soll in vitro und in vivo die Wirksamkeit einer Kombinationstherapie bestehend aus einem ETAR-Antagonisten und Bevacizumab bestimmt werden.

Mögliche Interaktionswege zwischen ET-Achse und VEGF-vermittelten Signalreduktion — Mögliche Interaktionswege zwischen der ET-Achse und der VEGF-vermittelten Signaltransduktion [Matsuura et al. 1998, Spinella et al. 2002]

Weiteres

Etablierung verschiedener Brustkrebs-Metastasierungsmodelle in vivo, kombiniert mit innovativer molekularer Fluoreszenzbildgebung (FMI)
Einfluss selektiver ETAR-Antagonisten auf das Expressionprofil sowie das Proliferations-, Migrations- und Invasionsverhalten verschiedener Brustkrebszellen
Interaktion von Endothelinsystem und Cyclooxygenease-2 (COX-2)
Differentielle Effekte von Aromataseinhibitoren und Antiöstrogenen auf das Östrogenrezeptor-Expressionsmuster verschiedener Brustkrebszelllinien

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Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Martin Götte
Leiter des Forschungslabors
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Telefon: +49 (0)251 / 83 - 56117
E-Mail: martin.goette(at)ukmuenster(dot)de

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Verwendung von Gewebechips (Tissue microarrays, TMA) mit hunderten von Mammakarzinom-Stanzzylindern zur high throughput Analyse (links: TMA-Block; rechts: gefärbter Schnitt eines TMA

Kaplan-Meier Kurven zum Überleben in Abhängigkeit von der ETAR-Expression: Patientinnen mit einem ETAR-positiven Mammakarzinom zeigen ein signifikant kürzeres krankheitsfreies Überleben (disease-free survival) als Patientinnen mit ETAR-negativem Tumor

Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe

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